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ligation & transformation

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작성일18-01-17 05:43

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대표적인 Ⅱ형 제한효소의 인식염기배열과 절단위치
AluI and HaeIII produce “Blunt ends”

BamHI, HindIII and EcoRI produce “Sticky ends”
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Ligation
DNA ligation 반응을 진행할 때에는 두 말단이 만나는 확률이 높아질 수 있도록 ligation이 되는 DNA를 고농도로 사용해주어야 한다
DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정 (연결)을 말하며, 예를 들어, 제한효소(restriction endonuclease) 에 의해서 서로 상보적인 말단을 갖는 두 DNA 분자를 연결하는 것이다
이 연결은 말단의 염기들 사이에 인산디에스테르 결합 (phosphodiester bond) 을 통해서 이루어지며, 이러한 반응을 촉매하는 효소가 DNA ligase이다
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T-vector
600bp →
500bp →
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Method
1. 같은 절단부위(restriction site)를 갖는 두 DNA를 준비한다
2. DNA fragment와 vector를 E-tube에 넣어준다
3. 10x ligation buffer 2㎕, 증류수 , T4 DNA ligase 1㎕를 넣고 섞어준다
4. 16˚C에서 4시간 이상 반응시킨다


레포트/기타

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다. 염기서열은 특이적으로 인식하지만, 인식자리에서 약 1000개 염기 정…(투비컨티뉴드 ) 도 떨어진 곳에서 비특이적으로 DNA를 자른다
Ⅱ형 (Type Ⅱ) : 인식자리가 특이적이고 제한자리 또한 주변의 염기로 특이적으로 작용한다. Ⅱ형 안에는 연관성이 낮은 여러 가지 제한효소가 섞여 있어서, 8개형으로 세분하여 분류한다(orthodox Ⅱ형, ⅡS형 등)
Ⅲ형 (Type Ⅲ) : Ⅰ형과 마찬가지로, 제한효소와 메틸화효소가 합쳐져 있다아 효소 활성에 ATP가 꼭 필요하고, 완전 절단이 거의 일어나지 않는 특징이 있다아 DNA를 자르기 위해서는 DNA 분자 반대 방향으로 놓여 있는 또 다른 인식 염기서열이 있어야 한다.

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Ligation &
Transformation
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Cloning vector
목적인 DNA를 삽입하여 대장균 등에서 증폭, 유지하기 위한 매개체로, vector DNA는 제한효소로 절단하여 상보적인 절단부위를 갖는 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주균에 도입할 수 있다
목적 DNA 단편을 연결한 vector DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 목적 DNA단편을 대대로 유지할 수 있다
Cloning vector의 종류
- Plasmid : pBR322, pUC18
- Phage : lambda phage, M13 phage
- Cosmid : Cos(from lambda phage) + plasmid
- Artificial chromosome(인공 염색체) :
BAC (Bacterial Artificial Chromosome),
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
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Plasmid vector의 advantage(장점)
1. 복제기점(origin of replication)을 갖기 때문에 증식할 수 있다
2. 항생제 내성 유전자 (antibiotic resistance gene)
을 가져 selection marker로 사용될 수 있다
3. Multi cloning site(MCS)가
존재하여 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있다
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제한효소(Restriction endonucleases)
특성(特性)에 따라 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ형 제한효소로
분류한다
DNA의 특정한 염기배열을 식별하고, 이중사슬 구조에서 nucleotide가 연결된 phosphodiester bond (인산-디에스테르 결합)를 절단하는 핵산분해 효소의 하나이다
Ⅰ형 (Type Ⅰ) : 제한효소와 메틸화효소가 뭉쳐져 있고, 인식자리와 제한자리가 서로 다르다. 실험실에서 주로 사용하는 것이 이 Ⅱ형이다.

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